Caspase-9 Activity Assay Kit (Colorimetric)

 Caspase-9活性檢測試劑盒（比色法）

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Caspases（Cysteine-requiringAspartate Proteases）是一個高度保守的半胱an酸蛋白酶家族，特異性識別底物中的天冬氨酸殘基，在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。Caspases以潛在酶原的形式表達，通過自發(fā)蛋白分解機制或經(jīng)其他蛋白酶（通常是其他caspases）加工處理的方式被活化。人caspases可細分為三大功能組：細胞因子活化（caspase-1，-4，-5和-13），凋亡啟動（caspase-2，-8，-9和-10）和凋亡執(zhí)行（caspase-3，-6和-7）。

Caspase-9（Caspase 9），也稱為Mch6，ICE LAP6和Apaf3，作為caspases家族的成員之一，含CARD結(jié)構(gòu)域（caspase募集結(jié)構(gòu)域），是細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中比較上游的一個caspase。Caspase-9酶原分子量約47kDa，存在于胞漿內(nèi)，一旦活化，轉(zhuǎn)移到線粒體。Caspase-9參與caspase活化級聯(lián)，負責(zé)凋亡執(zhí)行，和切割/活化下游的caspase-3和caspase-6。當募集到Apaf1/細胞se素c復(fù)合物后，caspase-9被激活。Caspase-9的激活可通過磷酸化進行調(diào)控。

Caspase-9活性檢測試劑盒（比色法）（Caspase-9 Activity Assay Kit, Colorimetric or Caspase-9 Colorimetric Assay Kit）以偶聯(lián)上發(fā)色基團pNA的caspase-9序列特異性的多肽為底物。當?shù)孜锉籧aspase-9剪切后，發(fā)色基團被釋放出來，進而用酶標儀或分光光度計來測定其吸光值（λ=405nm或400nm）。通過計算OD凋亡誘導(dǎo)組/OD陰性對照組的比值來確定凋亡誘導(dǎo)組caspase-9的活化程度。

本品適用于培養(yǎng)細胞以及新鮮組織的caspase-9活性檢測。

產(chǎn)品包裝

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，1年有效。開盒后置Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于2-8℃保存。Caspase-9Substrate和0.1M DTT需要避光凍存。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） Caspase-9 Substrate需避光保存和使用。

2） 某些凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的凋亡可能通過caspase-9非依賴的方式進行，此種情況使用本品檢測的caspase-9活性無明顯變化，則，需要考慮凋亡機制中的其他信號通路。

3） 起始細胞數(shù)量需達3~5×106個或新鮮組織量達50~100mg，以保證達到測定所需的100~200μg蛋白量。Caspase-9的活性與細胞裂解后的蛋白含量有關(guān)，如測定的OD值偏低，可通過增加細胞數(shù)量或組織量的方法來提高蛋白量。

4） 優(yōu)先選擇測定λ=405nm的吸光值；如有困難，再測定λ=400nm的吸光值。

5） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1.需要的其他試劑和材料

儀器：低溫高速離心機、酶標儀或分光光度計（100μl的比色皿）（λ=405nm或400nm）、微量移液器、玻璃勻漿器（組織樣本）

耗材：1.5ml微量離心管、96孔酶標板（透明）或100μl的比色皿

試劑：PBS、蛋白定量試劑（比如：Bradford法蛋白濃度測定試劑盒）

2.試劑準備

2.1 Lysis Buffer（含DTT）

于實驗前，按每50μl Lysis Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的裂解工作液，置于4℃或冰上待用。

2.2 2×Reaction Buffer（含DTT）

于使用前，按每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的反應(yīng)工作液。

3.樣本準備

3.1 細胞裂解

a）用合適方法誘導(dǎo)細胞凋亡，同時設(shè)立陰性對照組（不加誘導(dǎo)劑），收集3~5×106個細胞。

b）PBS洗滌細胞2次（2000rpm，離心5min），盡量吸盡PBS上清。

c）往離心的沉淀細胞中加入15~200μl預(yù)冷的Lysis Buffer（含DTT），吹打混勻。

d）置冰上裂解20~60min，其間渦旋振蕩3~4次，每次10s；或凍融2~3次。

e）4℃，10,000rpm離心1min。

f）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)移到新的EP管內(nèi)，置于冰上待用。

g）取少量上清（1~2μl），用常規(guī)方法（Bradford法）測定蛋白濃度。

3.2 組織裂解

a）取50~100mg組織置于培養(yǎng)皿內(nèi)，用手術(shù)剪剪碎成3mm×3mm左右的小塊，加入150~200μl預(yù)冷的Lysis Buffer（含DTT），用玻璃勻漿器上下手動勻漿15次，注意低溫操作。

b）將組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml預(yù)冷的離心管，10,000rpm，4℃離心5min。

c）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)移到新的EP管內(nèi)，置于冰上待用。

d）取少量上清（1~2μl），用常規(guī)方法（Bradford法）測定蛋白濃度。

4.Caspase-9活性檢測

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